裸鼠甲種胎兒球蛋白/甲胎蛋白(AFP)elisa試劑盒說明書

                          裸鼠甲種胎兒球蛋白/甲胎蛋白(AFP)elisa試劑盒說明書

檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被人鈣衛(wèi)蛋白（Calprotectin）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人鈣衛(wèi)蛋白（Calprotectin）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1.   血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.   血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.   細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.   組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.   保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1.     酶標儀（450nm）

2.     高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.     37℃恒溫箱

操作注意事項

1.   試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再使用。

2.   實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.   標準品稀釋液即可視為陰性對照或者空白；預(yù)處理后的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可。

4.   嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5.   所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

名稱96孔配置48孔配置備注

微孔酶標板12孔×8條12孔×4條無

標準品（120μg/g）0.6mL0.6mL按說明書進行稀釋

標準品稀釋液6mL3mL無

樣本稀釋液6mL3mL無

檢測抗體-HRP10mL5mL無

20×洗滌緩沖液25mL15mL按說明書進行稀釋

底物A6mL3mL無

底物B6mL3mL無

終止液6mL3mL無

封板膜2張2張無

說明書1份1份無

自封袋1個1個無

注：標準品用標準品稀釋液依次稀釋為：120、60、30、15、7.5、3.75 μg/g

試劑的準備

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1.   手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.   自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

1.   從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.   設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.   待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

4.   隨后標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.   棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.   每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.   每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應(yīng)OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

試劑盒性能

1.   準確性：標準品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

2.   靈敏度：最低檢測濃度小于1.0μg/g。

3.   特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4.   重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

5.   貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.   有效期：6個月

免責(zé)聲明

1.   試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實驗者承擔(dān)，本公司概不負責(zé)。

2.   嚴格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔(dān)。